近日，國家藥監(jiān)局發(fā)布《重組人源化膠原蛋白原材料評價指導(dǎo)原則（2023年第16號）》，本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)醫(yī)療器械注冊申請人對醫(yī)療器械所用重組人源化膠原蛋白原材料進行充分的研究，并整理形成產(chǎn)品注冊申報資料，同時也為技術(shù)審評部門對重組人源化膠原蛋白制成的產(chǎn)品注冊申報資料包括所引用主文檔相關(guān)內(nèi)容的技術(shù)審評提供參考。

重組人源化膠原蛋白原材料評價指導(dǎo)原則 

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊申請人對醫(yī)療器械所用重組人源化膠原蛋白原材料進行充分的研究，并整理形成產(chǎn)品注冊申報資料，同時也為技術(shù)審評部門對重組人源化膠原蛋白制成的產(chǎn)品注冊申報資料包括所引用主文檔相關(guān)內(nèi)容的技術(shù)審評提供參考。

本指導(dǎo)原則系對醫(yī)療器械用重組人源化膠原蛋白原材料的一般要求，適用于人膠原蛋白的所有型別，注冊申請人需依據(jù)具體醫(yī)療器械產(chǎn)品的特性對產(chǎn)品注冊申報資料涉及的原材料相關(guān)內(nèi)容進行充實和細化，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容的適用性。本指導(dǎo)原則不直接涉及重組人源化膠原蛋白原材料制成的醫(yī)療器械終產(chǎn)品的安全性或有效性評價，具體產(chǎn)品的評價請參考相應(yīng)的產(chǎn)品注冊審查指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是對注冊申請人和技術(shù)審評人員的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，亦不作為法規(guī)強制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細的研究資料和驗證資料；需在遵循相關(guān)法規(guī)和強制性標(biāo)準(zhǔn)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將進行適時的調(diào)整。

一、前言

近年來，隨著基因重組、蛋白質(zhì)組學(xué)等基礎(chǔ)理論、技術(shù)手段和臨床醫(yī)療探索研究的不斷發(fā)展，重組膠原蛋白日益成為重要的生物材料，為相關(guān)醫(yī)療器械的研發(fā)提供了新的思路與方法。重組人源化膠原蛋白是由DNA重組技術(shù)制備的人膠原蛋白特定型別基因編碼的全長或部分氨基酸序列片段，或是含人膠原蛋白功能片段的組合。

重組人源化膠原蛋白僅是重組膠原蛋白的一類，材料特性并不能完全決定最終產(chǎn)品的安全性和有效性。本指導(dǎo)原則中的“原材料”是指用于生產(chǎn)制造醫(yī)療器械用的重組人源化膠原蛋白材料。除特別說明外，本指導(dǎo)原則中的“材料”等同于“原材料”。

重組人源化膠原蛋白是通過基因工程生產(chǎn)的蛋白，工程細胞構(gòu)建過程、生產(chǎn)用細胞的質(zhì)量控制及常規(guī)生產(chǎn)過程控制是該原材料生產(chǎn)工藝及風(fēng)險評價的基礎(chǔ)，此方面主要的驗證資料，可參考本指導(dǎo)原則的資料性附件作為原材料研究資料的補充，但不作為產(chǎn)品注冊申報資料的必要內(nèi)容。結(jié)合重組人源化膠原蛋白的特點，該資料性附件修改引用了國家藥監(jiān)局藥審中心《重組制品生產(chǎn)用哺乳動物細胞質(zhì)量控制技術(shù)評價一般原則》《體外基因修飾系統(tǒng)藥學(xué)研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則》等生物制品指導(dǎo)原則的相關(guān)內(nèi)容。

二、評價要點

（一） 重組人源化膠原蛋白原材料性能研究

為了確保重組人源化膠原蛋白原材料質(zhì)量可控，重組人源化膠原蛋白需參考相關(guān)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進行必要的鑒別、純度和雜質(zhì)等分析，可采用不同的分析方法對原材料的分子量、等電點、氨基酸序列、各種翻譯后修飾（如脫酰胺化、氧化、糖譜/糖基化修飾、脯氨酸羥基化等）進行充分鑒定，并進行相應(yīng)的檢測，以確認(rèn)終產(chǎn)物具有擬宣稱的原材料構(gòu)象、聚集狀態(tài)、降解狀態(tài)及膠原蛋白高級結(jié)構(gòu)。

材料理化特性分析需按照醫(yī)療器械制備工藝和特點，結(jié)合其風(fēng)險控制要求進行相關(guān)研究，建議對如下常規(guī)理化項目進行研究，例如氨基酸序列、蛋白空間結(jié)構(gòu)、劑型（如溶液、凍干粉、凝膠、纖維、海綿等）、膠原蛋白型別等特異性性能，同時結(jié)合醫(yī)療器械特點，完善理化性能指標(biāo)要求。

需根據(jù)不同的預(yù)期用途及使用部位、不同生產(chǎn)工藝、預(yù)期使用效果和最終醫(yī)療器械的狀態(tài)，選擇適用的指標(biāo)；根據(jù)膠原蛋白原材料是否經(jīng)過交聯(lián)或化學(xué)修飾，宜提供交聯(lián)劑或修飾劑的殘留量、降解性能等的研究，提供相應(yīng)的研究報告。

性能指標(biāo)的建立及驗證取決于膠原蛋白原材料性質(zhì)和用途、生產(chǎn)和純化工藝及生產(chǎn)工藝的經(jīng)驗等多種因素。新的分析技術(shù)及對現(xiàn)有技術(shù)的改進正在不斷進行，適當(dāng)時需使用這些新的技術(shù)。因現(xiàn)有技術(shù)原因而產(chǎn)生偏差的需進行合理性解釋說明。

1.鑒別

1.1氨基酸序列及覆蓋度

首先需明確氨基酸序列的選擇依據(jù)，如為特定氨基酸序列片段組成的，還需明確片段重復(fù)次數(shù)及依據(jù)。需采用綜合的方法測定目標(biāo)膠原蛋白原材料的氨基酸序列，并與其基因序列對應(yīng)的理論氨基酸序列進行比較驗證。肽段覆蓋率的檢測結(jié)果需為100%覆蓋，末端氨基酸序列檢測結(jié)果需與理論序列完全一致?？砂凑铡吨亟M人源化膠原蛋白》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的要求，直接使用供試品檢測，并選擇適宜的酶解條件進行水解，酶解后選擇不小于5個連續(xù)氨基酸的片段為基本的序列單元進行覆蓋分析。

如適用，目標(biāo)膠原蛋白材料的理論氨基酸序列需包括二硫鍵連接方式。氨基酸序列測定還需考慮可能存在的N端甲硫氨酸（如大腸桿菌來源的膠原蛋白原材料），信號肽或前導(dǎo)序列。

1.1.1氨基酸組成

使用各種水解法和分析手段測定氨基酸的組成，并與目的蛋白基因序列推導(dǎo)的氨基酸組成或天然異構(gòu)體比較。如需要時需考慮分子量的大小。多數(shù)情況下，氨基酸組成分析對肽段和小蛋白可提供有價值的結(jié)構(gòu)資料，但對大蛋白一般意義較小。在多數(shù)情況下，氨基酸定量分析數(shù)據(jù)可用于確定蛋白含量。

1.1.2氨基酸末端序列

氨基酸末端分析用于鑒別N-端和C-端氨基酸的性質(zhì)和同質(zhì)性。用氨基酸序列分析儀或質(zhì)譜法測定N端和/或C端氨基酸序列，其結(jié)果需符合理論預(yù)測。

若發(fā)現(xiàn)目的膠原蛋白材料的末端氨基酸發(fā)生改變時，需使用適當(dāng)?shù)姆治鍪侄闻卸ㄗ儺愺w的相應(yīng)變異數(shù)量。需將這些氨基酸末端序列與來自目的膠原蛋白基因序列推導(dǎo)的氨基酸末端序列進行比較。

1.2肽圖

按照《中華人民共和國藥典》 四部 通則 肽圖檢查法 第一法 胰蛋白酶裂解-反相高效液相色譜法進行測定，建立膠原蛋白原材料標(biāo)準(zhǔn)肽圖。

推薦利用四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀（Q-TOF MS）建立標(biāo)準(zhǔn)肽圖，作為膠原蛋白材料的指紋圖譜，用于材料的批間一致性和穩(wěn)定性評價，以及材料特異性的鑒別。

需用合適的酶或化學(xué)試劑使所選的材料片段產(chǎn)生不連續(xù)多肽，應(yīng)用高效液相色譜法（HPLC）或其他適當(dāng)?shù)姆椒ǚ治鲈摱嚯钠?。盡量應(yīng)用氨基酸組成分析技術(shù)，N-末端測序或質(zhì)譜法鑒別多肽片段。至少對材料成品放行來說,經(jīng)驗證的肽譜分析經(jīng)常是確證目的材料結(jié)構(gòu)/鑒別的適當(dāng)方法。具體分析方法可參考《重組膠原蛋白肽圖指紋圖譜分析》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3分子量

對申報醫(yī)療器械所用膠原蛋白材料可參照《中華人民共和國藥典》高效液相色譜法、“電泳法”的“第五法  SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法”、基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜方法建立分子量及分布檢測方法，也可以運用其他適當(dāng)技術(shù)測定分子量，如分子排阻色譜法等。需通過至少一種合理的、經(jīng)驗證的方法證明其實際分子量與理論預(yù)測一致。

高效液相色譜法目標(biāo)蛋白的出峰保留時間需與參比品一致；高分辨質(zhì)譜法分子量需與參比品一致；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分子量電泳條帶位置需與參比品一致。同時，需就參比品的選擇提供合理性依據(jù)。

1.4等電點

按照《中華人民共和國藥典》 四部通則 電泳法第六法（等電聚焦電泳法）或0542毛細管電泳法進行檢測，等電點需在標(biāo)示范圍內(nèi)，也可以運用其他適當(dāng)?shù)姆椒y定。

1.5巰基和二硫鍵

如果目的膠原蛋白材料的基因序列存在半胱氨酸殘基時，需盡可能確定巰基和/或二硫鍵的數(shù)量和位置。使用方法包括肽譜分析（還原和非還原條件下）、質(zhì)譜測定法或其他適當(dāng)?shù)姆椒ā?/p>

1.6消光系數(shù)（或克分子吸光度）

多數(shù)情況下，可取目的膠原蛋白材料于UV/可見光波長處測定消光系數(shù)（或克分子吸光度）。消光系數(shù)的測定為使用UV/可見光或分光光度計檢測已知蛋白含量的溶液，蛋白含量應(yīng)用氨基酸組成分析技術(shù)或定氮法等方法測定。

1.7電泳圖型

應(yīng)用PAGE電泳、等電聚焦、SDS－PAGE電泳、免疫印跡、毛細管電泳法或其他適當(dāng)?shù)姆椒?獲得目的膠原蛋白材料的一致性，同一性和純度的電泳圖譜和數(shù)據(jù)。

1.8液相色譜圖譜

應(yīng)用分子篩色譜、反相液相色譜、離子交換液相色譜、親和色譜或其他適當(dāng)方法，獲得目的膠原蛋白材料的一致性、同一性和純度的色譜圖譜和數(shù)據(jù)。

2.結(jié)構(gòu)表征

2.1脯氨酸羥基化

若在設(shè)計時進行脯氨酸羥基化，需按YY/T 1849《重組膠原蛋白》中的要求進行分析，并規(guī)定標(biāo)示值。

2.2高級結(jié)構(gòu)分析

鑒于高級結(jié)構(gòu)與重組人源化膠原蛋白表現(xiàn)出的性能和功能密切相關(guān)，若材料擬宣稱具有相應(yīng)的高級結(jié)構(gòu)，采用多種方法對高級結(jié)構(gòu)進行研究分析，包括以下列舉的方法及其他結(jié)構(gòu)表征方法，如冷凍電鏡、蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)等方法。

2.2.1三螺旋結(jié)構(gòu)分析

可采用圓二色譜在特定常規(guī)試驗條件下的檢測重組人源化膠原蛋白的CD光譜特征。若采用特定的非常規(guī)條件檢測，則檢測結(jié)果僅反映膠原蛋白材料在該條件下可（否）具有形成類似膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)的CD光譜特征能力；此時需分析并闡述所檢測樣品是否代表“原材料樣品”，還是“原材料樣品”的特定處理（后續(xù)加工）樣品。同時建議進行最低檢出限分析，其結(jié)果需與生理性膠原蛋白相近（相差不超過一個數(shù)量級）?？刹捎肵射線晶體學(xué)技術(shù)或冷凍電鏡技術(shù)在原子結(jié)構(gòu)水平考證膠原蛋白材料或其包含的特定氨基酸序列的三螺旋結(jié)構(gòu)特性，計算有結(jié)構(gòu)信息的序列占整個蛋白序列的百分比；可采用差示掃描量熱法檢測膠原蛋白材料結(jié)構(gòu)變化的熱效應(yīng)輔助說明膠原蛋白的高級結(jié)構(gòu)特征；可采用紅外光譜進行結(jié)構(gòu)分析，其非特征區(qū)（如：酰胺a、b）和特征區(qū)（如：酰胺I、酰胺II、酰胺III）的特征峰位置需與參比品一致；可采用拉曼光譜，其拉曼光譜圖需與參比品一致；也可應(yīng)用其它紫外或可見光吸收光譜法、核磁共振（NMR）等適當(dāng)?shù)姆椒z測。

2.2.2纖維質(zhì)量/多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)表征

若材料預(yù)期形成纖維/網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)時，宜使用掃描電子顯微鏡（SEM）、透射電子顯微鏡（TEM）或原子力顯微鏡（AFM）等方法觀察膠原蛋白材料形成膠原纖維束/多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)等，需明確兩種方法具體的制樣和觀察測定過程。與此相關(guān)的膠原分子自組裝和聚合能力分析，可參考相關(guān)國內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進行研究。

3.純度

關(guān)于純度的要求可根據(jù)醫(yī)療器械終產(chǎn)品的用途和用法而確定。存在二硫鍵時重組人源化膠原蛋白可能會形成寡聚體，且其電泳分子量大小需成倍增加，寡聚體需視為重組人源化膠原蛋白而非雜質(zhì)。

4.含量

需建立重組人源化膠原蛋白含量檢測方法，含量以質(zhì)量/重量或質(zhì)量/體積表示。含量檢測可通過液相色譜法（HPLC）、凱氏定氮法、特征多肽法等。

5.雜質(zhì)、污染物和添加劑

對膠原蛋白材料工藝相關(guān)雜質(zhì)以及外源污染物等進行研究，如：細胞基質(zhì)來源、細胞培養(yǎng)來源和下游工藝。需對潛在的工藝相關(guān)雜質(zhì)（如宿主細胞蛋白質(zhì)、宿主細胞DNA、細胞培養(yǎng)殘留物、下游工藝的殘留物等）進行鑒別、評估，并進行定性和/或定量分析，并采用適宜的方法評價其對生物學(xué)功能的影響。工藝相關(guān)雜質(zhì)來源于生產(chǎn)工藝，可分三大類：來源于細胞基質(zhì)、培養(yǎng)基和下游工藝。細菌內(nèi)毒素、微生物限度和無菌性，是常規(guī)的污染物控制要求。

5.1源于細胞基質(zhì)的雜質(zhì)

來源于細胞基質(zhì)的雜質(zhì)包括源于宿主生物體的蛋白/多肽；核酸（宿主細胞/載體/總DNA）；多糖及病毒。對于宿主細胞蛋白，一般需用能檢測出較寬范圍蛋白雜質(zhì)的靈敏的免疫檢測方法。需用不含目的基因的生物體粗提物，即不含膠原蛋白編碼基因的生產(chǎn)用細胞，制備上述試驗使用的多克隆抗體?？赏ㄟ^對膠原蛋白材料的直接分析方法（如雜交技術(shù)法）檢測宿主細胞的DNA水平，和/或通過標(biāo)記試驗（實驗室規(guī)模）檢測證實通過純化工藝能去除核酸。對于有意導(dǎo)入的病毒，需驗證生產(chǎn)工藝中去除/滅活病毒的能力。

5.1.1外源性DNA殘留量

按照《中華人民共和國藥典》“外源性DNA殘留量測定法”的“熒光染色法”或“定量PCR法”進行測定，“熒光染色法”的樣品加標(biāo)回收率需滿足70%～130%；“定量PCR法”的樣品加標(biāo)回收率需滿足50%～150%，需規(guī)定殘留限量。如果樣品中外源性DNA殘留量低于“熒光染色法”的檢測限，則需采用“定量PCR法”進行測定。

需根據(jù)醫(yī)療器械產(chǎn)品的預(yù)期臨床用途、使用量等，確定含重組人源化膠原蛋白的材料臨床最大使用量的外源性DNA殘留量限值。推薦參考生物制品外源性DNA殘留限量要求，結(jié)合殘留DNA宿主類型及其風(fēng)險程度設(shè)定每人每次最大使用量限值。

建議參考生物制品中大腸桿菌或酵母菌表達的基因工程重組生物制品的外源性DNA殘留量限度。

5.1.2宿主細胞蛋白質(zhì)殘留量

5.1.2.1大腸桿菌蛋白質(zhì)殘留量

按照《中華人民共和國藥典》“大腸埃希菌菌體蛋白質(zhì)殘留量測定法”或采用經(jīng)驗證的酶聯(lián)免疫試劑盒進行測定。

5.1.2.2酵母蛋白質(zhì)殘留量

按照《中華人民共和國藥典》“酵母工程菌菌體蛋白質(zhì)殘留量測定法”或采用經(jīng)驗證的酶聯(lián)免疫試劑盒進行測定。

5.1.2.3CHO細胞蛋白質(zhì)殘留量

采用經(jīng)驗證的酶聯(lián)免疫試劑盒進行測定。

5.1.3促炎性污染物（肽聚糖）

采用經(jīng)驗證的方法或經(jīng)驗證的市售細菌肽聚糖檢測試劑盒（ELISA）檢測殘留肽聚糖，需根據(jù)其致熱反應(yīng)風(fēng)險規(guī)定可接受的限量要求。

5.1.4碳水化合物結(jié)構(gòu)

根據(jù)細胞基質(zhì)等因素，必要時需考慮測定糖蛋白中碳水化合物的含量（中性糖、氨基糖、唾液酸）。此外，盡可能分析碳水化合物的結(jié)構(gòu)、寡糖形態(tài)（長鏈狀）和多肽的糖基化位點。

5.2源于培養(yǎng)基的雜質(zhì)

來源于培養(yǎng)基的雜質(zhì)包括誘導(dǎo)劑（多核苷酸，病毒）、抗生素、血清及其他培養(yǎng)基組分。需根據(jù)工藝中采用的表達體系和使用的抗生素類型，采用經(jīng)驗證的方法測定殘余抗生素含量/活性，殘余抗生素含量需符合《重組人源化膠原蛋白》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，不應(yīng)有殘余抗生素活性。

殘余抗生素含量的測定按照YY/T 1849《重組膠原蛋白》中描述的方法或其他經(jīng)驗證的方法進行檢測，殘余抗生素活性按照《中華人民共和國藥典》 四部通則 生物活性測定法中抗生素微生物檢定法或《中華人民共和國藥典》 四部通則 抗生素殘留量檢查法進行檢測。

5.3源于下游工藝產(chǎn)生的雜質(zhì)

來源于下游工藝產(chǎn)生的雜質(zhì)一般包括酶、化學(xué)/生化處理試劑（如溴化氰、胍、氧化劑和還原劑）、無機鹽（如重金屬、砷、非有色金屬離子）、溶劑、載體/配體（如單克隆抗體），及其他可濾過的物質(zhì)。需結(jié)合實際情況制定相關(guān)理化指標(biāo)。

5.3.1添加劑

如果使用了防腐劑、凍干保護劑等添加劑，需給出其限量要求和檢測方法。

5.3.2重金屬及微量元素含量需符合以下規(guī)定。

5.3.2.1重金屬元素

對工藝中添加的重金屬元素，需符合規(guī)定限值。

5.3.2.2重金屬含量

重金屬總量（以Pb計）需符合YY/T 1888《重組人源化膠原蛋白》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中的限值。

5.3.2.3微量元素含量

微量元素含量：砷（As）、汞（Hg）、鉛（Pb）、鉻（Cr）、鎘（Cd）、銅（Cu）、鉬（Mo）、鐵（Fe）、鎳（Ni）需符合YY/T 1888《重組人源化膠原蛋白》等相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中的要求。

5.4細菌內(nèi)毒素

細菌內(nèi)毒素相關(guān)限量要求需考慮醫(yī)療器械終產(chǎn)品與人體的接觸方式。

5.5微生物限度

若重組人源化膠原蛋白材料以微生物限度控制狀態(tài)提供，按照《中華人民共和國藥典》 四部通則 非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法和非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法進行檢測，結(jié)果需符合相關(guān)要求。

5.6無菌

若重組人源化膠原蛋白材料以無菌狀態(tài)提供，按照《中華人民共和國藥典》 四部通則 無菌檢查法進行檢測，結(jié)果需無菌。

5.7分子變異體

需對重組人源化膠原蛋白材料的各種分子變異體進行分離、鑒別和分析。如變異體的功能與目標(biāo)產(chǎn)物一致時可不做雜質(zhì)考慮。需考慮在生產(chǎn)和/或貯存期間膠原蛋白材料降解產(chǎn)物是否顯著增加及其與免疫原性的相關(guān)性。以下為最常見的目的膠原蛋白材料的分子變異體，并列出了相應(yīng)的檢測方法。

5.7.1化學(xué)修飾類型

各種非預(yù)期的翻譯后修飾是導(dǎo)致重組蛋白異質(zhì)性的重要質(zhì)量問題，如：脫酰胺化、氧化、糖譜/糖基化修飾等和其他可能的N端、C端修飾（如乙?；?、酰胺化或者由于外肽酶導(dǎo)致的部分降解以及C端加工、N端焦谷氨酸等），以及各種其他異質(zhì)性（如異構(gòu)化、碎片化、二硫鍵錯配、N-連接和O-連接的寡糖、聚集等）。適用時，需按YY/T 1849《重組膠原蛋白》中的要求，參照《重組膠原蛋白肽圖指紋圖譜分析》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進行分析。需考慮脫酰胺、異構(gòu)化、錯配二硫鍵連接和氧化形式的分離和鑒別。對這些變異體的分離和鑒別，可采用層析法、電泳法（如毛細管電泳）、質(zhì)譜法和/或光譜法（如圓二色譜）。需注意在修飾不會引起或只引起較小的分子量變化及結(jié)構(gòu)變化的情況下，這些方法可能無法鑒別。此時，需要結(jié)合功能性試驗，評價所發(fā)生的修飾是否影響預(yù)期的功能和使用。

5.7.2降解物和聚合體

降解物和聚合體：聚合體包括二聚體和多聚體，可用分子篩層析法（如SE-HPLC）進行定量；需建立成品中非預(yù)期降解物的判定標(biāo)準(zhǔn)，并對穩(wěn)定性試驗產(chǎn)生的降解產(chǎn)物進行監(jiān)測。

6.熱穩(wěn)定性

如果重組人源化膠原蛋白是多聚體，可采用差示掃描量熱分析（DSC）進行解聚溫度分析?？蓞⒖肌吨腥A人民共和國藥典》 四部。

如果是單鏈的蛋白肽，可參考《中華人民共和國藥典》 四部，人免疫球蛋白3.3.2.4熱穩(wěn)定性試驗，將供試品置（57±0.5）℃水浴中保溫4h后，用可見異物檢查裝置，肉眼觀察需無凝膠化或絮狀物。

7.其它理化指標(biāo)

膠原蛋白材料其它性能指標(biāo)宜根據(jù)醫(yī)療器械終產(chǎn)品特性及相關(guān)通用要求制定，在適用時，需對相關(guān)性能指標(biāo)檢測方法使用的參比品進行性能研究，對照品技術(shù)參數(shù)需明確且性能穩(wěn)定。用于理化測定等方面的參比品，需進行必要的分析鑒定，包括但不限于：

7.1外觀（如性狀、顏色）

用肉眼直接觀測，需為白色/淡黃色/無色透明液體或凝膠，或白色/類白色凍干粉或海綿狀固體。

注：隨著行業(yè)發(fā)展，可能存在其他外觀要求，需根據(jù)原材料具體形態(tài)規(guī)定外觀要求。

7.2可見異物

按照《中華人民共和國藥典》 四部通則 可見異物檢查法第一法（燈檢法）進行檢測，需無明顯異物。

7.3溶解性

需根據(jù)供試品的溶解特性，對供試品在水、稀酸或中性鹽溶液中的溶解程度進行表征和闡述。

7.4水分

適用時（如凍干樣品），需明確水分含量。除另有規(guī)定外，取供試品約1g～2g，按照《中華人民共和國藥典》“水分測定法”第二法（烘干法）測定，或取供試品約10mg按照《中華人民共和國藥典》“熱分析法”熱重法（TG）測定，升溫程序：從室溫以10℃/min速率升溫至105℃，保持60min。減失重量需符合所標(biāo)示范圍。規(guī)定仲裁方法為水分測定法。

7.5熾灼殘渣

除另有規(guī)定外，取1.0-2.0g，按照《中華人民共和國藥典》 四部通則 熾灼殘渣檢查法進行檢測。

7.6酸堿度

液體和凝膠樣品直接取樣，固體樣品用生理鹽水稀釋為1mg/mL，按照《中華人民共和國藥典》 四部通則“pH值測定法”進行檢測，需符合所標(biāo)示值的±1.0。

7.7滲透壓摩爾濃度

適用時，液體和凝膠樣品直接取樣，固體樣品用生理鹽水稀釋為1mg/mL按照《中華人民共和國藥典》 四部通則 滲透壓摩爾濃度測定法進行檢測，滲透壓摩爾濃度范圍需符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求。

7.8動力黏度（凝膠）

取供試品按照《中華人民共和國藥典》“黏度測定法”的“旋轉(zhuǎn)黏度計測定法”測定，需要詳細描述試驗條件，動力黏度值需符合所標(biāo)示范圍。

7.9裝量及差異

根據(jù)供試品性狀（溶液、凝膠、凍干海綿或凍干粉末等）和裝量的不同確定裝量的允差要求。例如：20g（mL）以下，單個裝量不低于標(biāo)示裝量的93%；20g（mL）至50g（mL），單個裝量不低于標(biāo)示裝量的95%；50g（mL）以上，單個裝量不低于標(biāo)示裝量的97%；平均裝量不低于標(biāo)示裝量。

8.降解特性及產(chǎn)物

需對膠原蛋白材料降解特性進行研究，可采用凝膠滲透色譜（GPC）測定降解產(chǎn)物的分子量分布及分子量，水解/酶解產(chǎn)物可使用氨基酸分析儀、高效液相色譜或其他適宜的方法測定。

9.生物學(xué)功能評價

重組膠原蛋白的生物學(xué)功能是指以重組膠原蛋白生物學(xué)特性相關(guān)屬性為基礎(chǔ)的生物學(xué)作用，對聲稱的生物學(xué)功能宜進行定性定量分析。膠原是細胞外基質(zhì)的主要成分，重組人源化膠原蛋白作為重組膠原蛋白的一種，其主要生物學(xué)功能也同樣是為細胞提供支架和良好的微環(huán)境，如促進細胞黏附、增殖、生長、分化等。因此，可通過評價細胞-膠原蛋白相互作用來評價重組人源化膠原蛋白的生物學(xué)功能。細胞增殖、分化、黏附性、遷移或移行評價方法可參考YY/T 1849《重組膠原蛋白》。

由于膠原類材料在分子組成、微結(jié)構(gòu)、物理性能方面可能差異顯著，需檢測材料與細胞之間相互作用及其引導(dǎo)細胞基礎(chǔ)響應(yīng)的性能。細胞響應(yīng)的參數(shù)包括細胞形態(tài)、面積和體積，均可通過二維（2D）或三維（3D）圖像技術(shù)可視化評價，還包括存活率、增殖率、程序化凋亡以及遷移。

鼓勵對重組人源化膠原蛋白對細胞的作用機理進行研究。例如，抗體阻斷試驗可用來確定細胞表面的何種受體參與了與膠原的作用，如整合素或盤狀結(jié)構(gòu)域受體（DDRs）。此外，細胞骨架成分（如肌動蛋白）的協(xié)同作用也可用來評價細胞與基質(zhì)間的粘附與收縮解離。有多種在單細胞或多細胞水平上評價細胞引導(dǎo)的收縮解離的方法，包括自由漂浮組織構(gòu)建物的尺寸隨時間的變化、施加在培養(yǎng)-力學(xué)監(jiān)測系統(tǒng)上力的大小，以及單個細胞在膠原網(wǎng)絡(luò)的應(yīng)力和形變等。

其它適用于干細胞和祖細胞類型的細胞-膠原相互作用的功能性檢測包括細胞株的定向分化，特定干細胞或祖細胞的增殖，或組織形態(tài)發(fā)生（始于內(nèi)皮祖細胞的血管形成）。按照《中華人民共和國藥典》 四部 進行成纖維細胞生長因子生物學(xué)活性測定，對膠原蛋白肽-細胞相互作用評價，反映膠原蛋白肽與成纖維細胞增殖的構(gòu)效關(guān)系。

按照《中華人民共和國藥典》 四部 生物活性測定法對試驗結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析，包括對驗證指標(biāo)結(jié)果的繪圖和統(tǒng)計學(xué)分析，以及判斷其是否符合可接受標(biāo)準(zhǔn)等。常規(guī)的統(tǒng)計學(xué)方法一般要求數(shù)據(jù)之間相互獨立，并呈近似正態(tài)分布和方差齊性，通常采用相對效價的對數(shù)轉(zhuǎn)換值進行數(shù)據(jù)分析。當(dāng)無法滿足上述統(tǒng)計學(xué)要求時，也可考慮采用其他適宜的替代方法進行數(shù)據(jù)分析。

上述關(guān)于膠原—細胞相互作用的功能性測定也可作為醫(yī)療器械產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量控制的方法。三維支架材料中細胞活性評價方法可參考YY/T 1562《組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品 生物材料支架 細胞活性試驗指南》。

（二） 材料免疫學(xué)安全性研究

臨床前安全性評價包括臨床前安全性試驗，其目的主要是確定新膠原蛋白材料是否會在人體引起未能預(yù)料的不良反應(yīng)，免疫學(xué)安全性研究是重組人源化膠原蛋白材料生物安全性研究資料的主體。但是，用傳統(tǒng)生物試驗方法來評價重組人源化膠原蛋白往往有困難，并受多種因素的影響。例如高度的種屬特異性，人的蛋白質(zhì)對人的生物學(xué)活性遠高于對動物的活性，而且人的蛋白質(zhì)氨基酸序列，常常與來自其它種系的蛋白質(zhì)不同，例如糖基。因而由基因工程技術(shù)所制備的蛋白質(zhì)或肽類往往會在人體以外的其它宿主中產(chǎn)生免疫應(yīng)答，其生物學(xué)效應(yīng)有所改變，并可能因形成免疫復(fù)合物而導(dǎo)致有毒性反應(yīng)，而這樣產(chǎn)生的毒性反應(yīng)與人體安全性顯然無關(guān)。

另外，由于重組人源化膠原蛋白功能、生產(chǎn)工藝或者膠原蛋白材料穩(wěn)定性等要求，對膠原蛋白材料進行修飾或者改構(gòu)，需提供與未修飾或者改構(gòu)材料比較的研究資料。以簡化生產(chǎn)工藝為目的而引入的額外多肽片段如His-tag，在最終的材料成品中需符合相關(guān)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的要求。

1.免疫原及免疫化學(xué)檢驗

基于部分人膠原蛋白核酸序列進行編輯組合而重組的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，特別是長期反復(fù)使用時，可能引起人體預(yù)測不到的免疫原性。因此，不能完全排除其免疫原性風(fēng)險，宜增加免疫學(xué)研究。重組人源化膠原蛋白作為醫(yī)療器械用原材料，可采用適宜方法進行免疫學(xué)評價。若用動物進行免疫學(xué)試驗，可能因為動物模型與臨床應(yīng)用之間存在種屬差異，帶來對評價試驗結(jié)果或評價試驗數(shù)據(jù)使用上的局限，需要根據(jù)臨床評價獲得的免疫學(xué)評價數(shù)據(jù)及動物模型獲得的免疫評價數(shù)據(jù)進行綜合評價分析。

患者對蛋白質(zhì)類材料產(chǎn)生免疫應(yīng)答的風(fēng)險將隨醫(yī)療器械產(chǎn)品變化而變化。建議采用基于風(fēng)險的方法來評價和減輕與影響人源化膠原蛋白安全性和有效性相關(guān)的免疫應(yīng)答。人源化膠原免疫原主要源自生產(chǎn)過程中殘留的可致免疫原性的各種因子，包括殘留的各種雜蛋白（包括DNA轉(zhuǎn)錄過程中可能產(chǎn)生的異種蛋白）、殘留的大腸桿菌及酵母菌外源性DNA、材料致熱原、生產(chǎn)過程中菌體產(chǎn)生的細菌內(nèi)毒素、DAMPs以及人源膠原特異性免疫等等。

為降低人源化膠原蛋白材料的免疫原性風(fēng)險，一般需在材料設(shè)計及生產(chǎn)工藝中采取相應(yīng)處理措施以降低其免疫原性，如宿主細胞選擇，蛋白提取、蛋白純化。注冊申請人需對其降低材料免疫原性的有效性進行驗證，并提供驗證試驗性數(shù)據(jù)或相關(guān)研究資料。注冊申請人需提供免疫原性檢測范例的理論依據(jù)，需使用經(jīng)完全驗證的檢測法對來自關(guān)鍵性研究的樣品進行檢測，并提供支持該檢測法的全面驗證的數(shù)據(jù)。

雜蛋白的檢測可參考YY/T 1453《組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品 I型膠原蛋白表征方法》，外源性DNA檢測可參考YY/T 0606.25《組織工程醫(yī)療產(chǎn)品 第25部分 動物源性生物材料DNA殘留量測定法：熒光染色法》。膠原蛋白材料的免疫原檢驗可通過流式細胞術(shù)（FCM）或酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定，檢測試驗宜考慮，但不限于淋巴細胞增殖試驗（YY/T 0606.15《組織工程醫(yī)療產(chǎn)品 第15部分 評價基質(zhì)及支架免疫反應(yīng)的試驗方法：淋巴細胞增殖試驗》）、細胞遷移試驗（YY/T 0606.20《組織工程醫(yī)療產(chǎn)品 第20部分：評價基質(zhì)及支架免疫反應(yīng)的試驗方法：細胞遷移試驗》），采用非標(biāo)方法時需進行方法學(xué)驗證。

免疫原性檢測可設(shè)計為檢測不期望的生物或生理結(jié)果的抗體，重組人源化膠原蛋白抗體可能降低效果或者引起過敏等反應(yīng)?？贵w檢測的免疫原試驗可參考《中華人民共和國藥典》，選擇適宜的方法進行，包括橋聯(lián)或均相酶免疫法、放射免疫沉淀試驗等，并進行相關(guān)的方法開發(fā)和試驗驗證。試驗過程中，可根據(jù)滴度試驗和中和活性試驗進一步對ADA進行分析，還可進行額外的抗體特征分析，包括抗體分型、抗原表位鑒定及交叉反應(yīng)評價。

篩選檢測法（也稱為結(jié)合抗體（BAb）檢測法）用于檢測與材料結(jié)合的所有抗體。使用確證性檢測法建立BAb對材料的特異性，使用滴定和中和檢測法進一步表征重組人源化膠原蛋白抗體。使用滴定檢測法表征抗體應(yīng)答的量級，抗體對安全性和有效性的影響可能與其滴度和持續(xù)性而不是發(fā)生率相關(guān)。中和檢測法評估抗體干擾材料-靶標(biāo)相互作用的能力。中和抗體（NAb）是BAb的亞類，ADA對安全性和有效性的影響可能與NAb活性而不是抗體發(fā)生率相關(guān)。類似地，在一些情況下可能重要的是確定NAb滴度。用于檢測抗體的首選檢測法應(yīng)當(dāng)是檢測低親和力和高親和力抗體的高靈敏度篩選檢測法。注冊申請人在開發(fā)檢測方法以確認(rèn)重組人源化膠原蛋白特異性抗體結(jié)合時，需選擇合適的確證性檢測法以防止抗體假陽性數(shù)據(jù)，這些假陽性數(shù)據(jù)會混淆抗體對安全性和有效性影響的分析。

注冊申請人需提供支持該檢測法的全面驗證的數(shù)據(jù)。驗證包括證明用于給定樣品中抗體的定量測量的特定檢測法對于預(yù)期用途是可靠和可重現(xiàn)的。抗體檢測法有助于評價材料的免疫原性，然而抗體的檢測依賴于檢測法的關(guān)鍵操作參數(shù)（如靈敏度、專屬性），一般來說，建議注冊申請人開發(fā)針對靈敏度、專屬性、選擇性、精確度、重復(fù)性和穩(wěn)定性進行優(yōu)化后的檢測法。

其他的免疫原評價及生物學(xué)性能及生物相容性評價等建議做醫(yī)療器械終產(chǎn)品的檢測，因為加工工藝不同最終產(chǎn)品性能不同，例如有些交聯(lián)工藝可能會封閉某些免疫原反應(yīng)簇等等。

2.免疫毒理學(xué)評價

當(dāng)擬生產(chǎn)醫(yī)療器械免疫原性風(fēng)險與已上市產(chǎn)品無可比性，且無充分的文獻數(shù)據(jù)評價其免疫原性，需進行免疫毒理學(xué)試驗研究。通過免疫毒理學(xué)試驗，對炎癥反應(yīng)、免疫抑制、免疫刺激、超敏反應(yīng)以及自身免疫進行確證評價，評估免疫系統(tǒng)改變導(dǎo)致的潛在人體不良健康作用。

免疫毒理學(xué)可通過流式細胞術(shù)（FCM）、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、組織病理切片等方法測定，試驗方法可考慮結(jié)合生物學(xué)試驗、體外T淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗（YY/T 1465.1《醫(yī)療器械免疫原性評價方法 第1部分 體外T淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗》）等，注冊申請人需對選用檢測方法的適用性進行評價，采用非標(biāo)方法時需進行方法學(xué)驗證。

可參考GB/T 16886.20《醫(yī)療器械免疫毒理學(xué)試驗原則和方法》選擇性進行功能性或非功能性免疫毒理學(xué)試驗，通過嚙齒動物試驗方式檢測和評價物質(zhì)的不良作用。目前主要研究方法是將醫(yī)療器械/材料植入小鼠/模式小鼠，然后研究器械/材料整個降解周期內(nèi)機體的體液和細胞的免疫應(yīng)答，以及局部組織的免疫反應(yīng)。功能性檢測測定細胞和/或器官活性，例如淋巴細胞對有絲分裂原或特異性抗原的增殖反應(yīng)、細胞毒性和特異性抗體的形成；非功能性檢測涵蓋形態(tài)學(xué)方面和/或定量的術(shù)語、淋巴組織變化程度、淋巴細胞數(shù)目和免疫球蛋白水平或其他免疫功能標(biāo)志物。

（三） 材料生物學(xué)風(fēng)險評價

作為制備醫(yī)療器械產(chǎn)品的原材料，需參照GB/T 16886.1的要求對重組人源化膠原蛋白原材料進行必要的生物學(xué)評價，尤其通過膠原蛋白材料到醫(yī)療器械終產(chǎn)品的加工工藝分析發(fā)現(xiàn)，兩者之間的生物學(xué)風(fēng)險相近時。如預(yù)期用于植入產(chǎn)品的原材料，還需評估樣品是否為內(nèi)源性凝血系統(tǒng)激活物。若醫(yī)療器械終產(chǎn)品與膠原蛋白材料的使用方法不一致，需考慮生物學(xué)補充研究。

根據(jù)GB/T 42062《醫(yī)療器械 風(fēng)險管理對醫(yī)療器械的應(yīng)用》描述的風(fēng)險管理過程進行生物學(xué)風(fēng)險評定，識別材料、添加劑、加工助劑和其他潛在可瀝濾物中的危害，接觸劑量等因素，繪制基于風(fēng)險管理的生物學(xué)評價流程圖。

如果醫(yī)療器械產(chǎn)品以非滅菌的方式提供，可將樣品滅菌后用于生物學(xué)評價試驗，需考慮滅菌方式及滅菌對重組人源化膠原蛋白的影響。

可能需要評價的生物學(xué)風(fēng)險評定終點包括但不限于：

1.細胞毒性

2.致敏性

注射膠原、膠原止血劑等具有潛在生物可降解性材料，或體內(nèi)植入材料以及材料制備過程中新增了化學(xué)成分和制造加工助劑、裝配粘合劑/溶劑殘留物，以及成品中可能存在滅菌殘留物或滅菌過程所致的反應(yīng)性產(chǎn)物時，需進行遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗。

3.皮膚刺激性

4.皮內(nèi)反應(yīng)

注射膠原、膠原止血劑等具有潛在生物可降解性材料或體內(nèi)植入材料以及材料制備過程中新增化學(xué)成分和制造加工助劑、裝配粘合劑/溶劑殘留物以及滅菌殘留物或滅菌過程所致的反應(yīng)性產(chǎn)物可能存在于成品時需進行皮內(nèi)刺激試驗。

5.材料介導(dǎo)的致熱性

6.全身毒性

7.溶血性

血管修復(fù)材料、創(chuàng)傷和燒傷修復(fù)材料、膠原止血劑、心臟瓣膜等與循環(huán)血液接觸的外部接入材料和大部分植入材料以及全部植入血管系統(tǒng)材料需進行溶血試驗。

8.植入反應(yīng)

皮下植入（膠原支架、血管修復(fù)材料、創(chuàng)傷和燒傷修復(fù)材料、膠原止血劑等可降解/可吸收材料或需植入生物材料等需進行皮下組織植入試驗進行評價）；肌肉植入；骨植入。

9.遺傳毒性。

（四） 穩(wěn)定性研究與直接接觸性容器/材料研究

1.穩(wěn)定性研究

重組人源化膠原蛋白生產(chǎn)過程中間體如涉及到貯存，則需開展相應(yīng)的穩(wěn)定性研究。采用擬貯存階段樣品的代表性批次開展研究，一般包括貯存、運輸（如適用）和使用穩(wěn)定性研究等。研究開展前，需統(tǒng)籌制定穩(wěn)定性研究方案，關(guān)注各穩(wěn)定性研究所用樣品、直接接觸性容器/材料、檢測時間點、檢測條件和分析檢項等。

研究中需對能夠反映質(zhì)量變化的敏感特征進行研究，如含量、完整性、純度、微生物安全性和生物學(xué)特性等。需依據(jù)相應(yīng)的醫(yī)療器械產(chǎn)品的貯存運輸條件開展研究，涵蓋設(shè)定的各項條件，如溫度、光照、反復(fù)凍融（冷凍貯存時）、振搖等方面。根據(jù)實際使用情況，開展使用中的穩(wěn)定性研究，例如復(fù)溶或解凍、與復(fù)溶稀釋劑的相容性研究等。研究中需采用與實際使用相同材質(zhì)的直接接觸性容器/材料。

2.直接接觸性容器/材料研究

如涉及貯存，需對直接接觸的包裝容器開展相應(yīng)的包材相容性研究。根據(jù)相容性研究結(jié)果，結(jié)合穩(wěn)定性研究，選擇合理的包裝容器。

另外，對制備工藝中與樣品接觸的容器和一次性使用材料（如貯存袋、過濾膜、層析介質(zhì)、管路等），需開展風(fēng)險評估和/或相應(yīng)的相容性研究。

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