之前寫過許多有關新冠核酸檢測試劑注冊相關文章，本文從科普角度，一方面為大眾介紹新冠核酸檢測試劑（熒光PCR法）注冊產(chǎn)品，另一方面為已取得新冠核酸檢測試劑（熒光PCR法）注冊證的生產(chǎn)企業(yè)，說說生產(chǎn)注意事項。

新冠核酸檢測試劑（熒光PCR法）注冊及生產(chǎn)注意事項：

1、概述

新型冠狀病毒(2019 -nCoV)是一種具有急性呼吸道傳染性的RNA病毒，其直徑在100 nm左右，有四種主要的結

構蛋白:刺突蛋白(Spike protein, S蛋白)，核衣殼蛋白(Nucleocapsid, N蛋白)，膜蛋白(Membrane protein, M蛋白)，包膜蛋白(Envelope protein, E蛋白)。N蛋白在冠狀病毒中含量豐富，是一種高度免疫原性蛋白，參與基因組復制和細胞信號通路調節(jié)。目前已獲證的新型冠狀病毒(2019-nCoV)核酸檢測試劑主要針對的靶標包括ORF1ab基因，E基因和N基因，其反應原理以實時熒光PCR法為主流方法學。

新型冠狀病毒(2019-nCoV) 核酸檢測試劑(熒光PCR法)的基本原理是以新型冠狀病毒(2019-nCoV)的特異性基因(包括ORF1ab基因、E基因和N基因)設計特異性引物和TaqMan探針，通過熒光定量PCR儀進行擴增，從而實現(xiàn)對新型冠狀病毒(2019-nCoV) 核酸的檢測。臨床樣本核酸提取后，進行一步法RT-PCR擴增，并檢測熒光信號，儀器軟件系統(tǒng)自動繪制出實時擴增曲線。同時設置內參照，主要對樣本采集、保存和運輸以及核酸提取過程進行監(jiān)控，避免假陰性結果的判。

2、產(chǎn)品組成(以某獲證產(chǎn)品為例)

通常由核酸擴增反應液、酶混合液、PCR檢測混合液、陽性對照和陰性對照組成( 見圖2)。擴增反應液中一般包含鎂離子、核苷酸混合液等擴增中必需的原料及緩沖液成分;酶混合液通常是各種酶的集合(如: DNA/RNA聚合酶、逆轉錄酶、UNG酶等) ; PCR 檢測混合液包括針對不同基因以及內參基因的引物/探針，根據(jù)不同企業(yè)設計驗證的結果，組分的名稱及具體成分可能略有差異，比如可能存在dNTPs等原料與引物/探針配制于同一管檢測液中的情況;陽性對照是含有特異性片段的病毒樣顆粒，陰性對照通常是生理鹽水或樣本保存液。

3、預期用途

主要用于體外定性檢測新型冠狀病毒肺炎疑似病例、其他需要進行新型冠狀病毒感染診斷或鑒別診斷者的鼻咽拭

子、口咽拭子、痰液樣本等中，新型冠狀病毒(2019-nCoV)的0RF1ab、N基因和E基因。部分企業(yè)已獲證產(chǎn)品只針對其

中某一種或兩種基因。有關“疑似病例”等人群的定義參照《新型冠狀病毒肺炎診療方案》、《新型冠狀病毒肺炎防控方案》 等文件執(zhí)行。在使用上應當遵守《新型冠狀病毒肺炎診療方案》、《新型冠狀病毒肺炎防控方案》等文件的相關要求。開展新型冠狀病毒核酸檢測，應符合《新型冠狀病毒肺炎實驗室檢測技術指南》等的要求，做好生物安全工作。最終的檢測結果僅供臨床參考，不得作為臨床診斷的唯一標準。建議結合患者臨床表現(xiàn)和其他實驗室檢測對病情進行綜合分析。

4、規(guī)格型號

因體外診斷試劑產(chǎn)品的工藝特殊性，最終成品的規(guī)格區(qū)別通常在于分裝體積或檢測人份數(shù)的不同，如: 50人份/盒、

96人份/盒等。

5、產(chǎn)品性能(以某獲證產(chǎn)品為例)

5.1外觀

在自然光下以正常視力或矯正視力目視檢查,試劑盒各組分齊全，標簽字跡清晰，說明書內容完整、詳細，外包裝盒完整。澄清均一液體，無肉眼可見渾濁或不溶性雜質。

5.2陽性參考品符合率

按試劑盒說明書要求檢測國家陽性參考品，應符合相應規(guī)定?；驒z測企業(yè)制備的陽性參考品P1-P5，結果均為陽性。

5.3陰性參考品符合率

按試劑盒說明書要求檢測國家陰性參考品，應均為陰性?；驒z測企業(yè)制備的陰性參考品N1-N12，結果均為陰性。

5.4精密度

按試劑盒說明書要求檢測國家精密性參考品, 10次檢測結果均為陽性，且Ct值的變異系數(shù)(CV, %)應不高于5.0%?；驒z測企業(yè)參考品中的精密度參考品3份(J1、 J2和J3)，重復檢測10次,計算精密度參考品J1.J2檢測結果FAM/VIC(HEX)通道的Ct平均值x和標準偏差SD,按式(1)計算變異系數(shù)CV，結果應不大于5. 0%; J3檢測10次結果均為陰性。

5.5最低檢出限

按試劑盒說明書要求檢測國家靈敏度參考品S，將其使用無RNA/DNA酶的去離子水進行1:3倍比稀釋(2份水+1份樣本，后同)后，將1:9、1:27、1:81. 1:243、1:729、1:2187.1: 6561、1:19683、 1:59049、 1:177147 分別標記為S1 ~S10,檢測結果S1^ S3應為陽性?；虬丛噭┖姓f明書要求檢測企業(yè)參考品中的最低檢出限參考品1份(L)，重復檢測3次，結果均為陽性。

8、關鍵原材料及性能要求

該類產(chǎn)品的主要原材料包括引物、探針、酶、dNTP、核酸分離/純化組分(如有)、質控品、參考品等。如主要原材料源于外購，供應商應固定，不得隨意更換。如主要原材料為企業(yè)自制，應能提供其詳細制備過程。

8.1引物和探針

質量標準應至少包括序列準確性、純度、濃度及功能性實驗等。

8.2 dNTP

包括dATP、dGTP、 dCTP、 dTTP、 dUTP (如有)，質量標準應至少包括純度、濃度、功能性等。

8.3酶

需要的酶主要包括DNA聚合酶、逆轉錄酶、尿嘧啶DNA糖基化酶(如有)等，質量標準應至少包括對酶活性和功能性等的驗證。

8.4質控品

試劑盒一般包含陰性質控品和陽性質控品。陽性質控品應包含試劑盒檢測的靶序列，可采用假病毒制備。質量標準中應對質控品的檢測結果Ct值范圍做出明確的要求。

8.5內標

又稱內對照，可對管內抑制導致的假陰性結果進行質量控制，應與靶核酸一同提取及擴增。質量標準中應明確內標的檢測結果Ct值范圍。

8.6企業(yè)參考品

一般包括陽性參考品、陰性參考品、檢出限參考品和重復性參考品。企業(yè)參考品應優(yōu)先采用臨床樣本，或者使用病毒培養(yǎng)物加入陰性基質。無法獲得臨床樣本或病毒培養(yǎng)物企業(yè)需說明其合理性。質量標準應包括功能性檢測等。應根據(jù)產(chǎn)品性能驗證的實際需要設置企業(yè)參考品。建議如下:

1)陽性參考品:著重考慮不同來源的病毒樣本和濃度要求，至少選取不同來源的5個病毒樣本。

2)陰性參考品:一般包括冠狀病毒(HKU1 .0C43、NL63、229E)、SARS冠狀病毒(可采用假病毒)、MERS冠狀病毒(可采用假病毒)、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等。不適用的陰性參考品企業(yè)需說明其合理性。

3)檢出限參考品:可采用95%陽性檢出水平或略高于檢出限的水平，如100%陽性檢出水平。

4)重復性參考品:一般包括高、低兩個濃度的樣本，其中一個濃度應為檢出限附近的濃度。

9、質量控制點

9.1 PCR檢測混合液的配制;

9.2核酸擴增反應液的分裝(如有) ;

9.3酶混合液的分裝;

9.4 PCR檢測混合液的分裝;

9.5陰性對照的分裝;

9.6陽性對照的配制;

9.7陽性對照的分裝。

更多有關新冠核酸檢測試劑注冊及生產(chǎn)事項相關疑問，歡迎您隨時方便與杭州證標客醫(yī)藥技術咨詢有限公司聯(lián)絡，聯(lián)系人：葉工，電話：18058734169，微信同。