B群鏈球菌核酸檢測試劑注冊(cè)技術(shù)

審查指導(dǎo)原則

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊(cè)申請(qǐng)人對(duì)B群鏈球菌核酸檢測試劑注冊(cè)申報(bào)資料的準(zhǔn)備及撰寫，同時(shí)也為技術(shù)審評(píng)部門對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的技術(shù)審評(píng)提供參考。

本指導(dǎo)原則是針對(duì)B群鏈球菌核酸檢測試劑的一般要求，申請(qǐng)人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化。

本指導(dǎo)原則是對(duì)申請(qǐng)人和審查人員的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊(cè)審批所涉及的行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但需要詳細(xì)闡明理由，并對(duì)其科學(xué)合理性進(jìn)行驗(yàn)證，提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料，相關(guān)人員應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時(shí)進(jìn)行調(diào)整。

一、適用范圍

    無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）在蘭氏抗原分類中屬于B群，B群目前只發(fā)現(xiàn)這一種細(xì)菌，所以一般也稱為B群鏈球菌（Group B Streptococcus，GBS）。GBS為一種β溶血的革蘭陽性球菌，成對(duì)或呈短鏈狀排列，根據(jù)細(xì)菌的莢膜多糖不同，GBS可分為Ia、Ib、Ic、II、III、IV、V、VI、VII、VIII和IX等。GBS是圍產(chǎn)期和新生兒感染疾病的致病菌，引起孕產(chǎn)婦的絨毛膜羊膜炎，導(dǎo)致流產(chǎn)、胎膜早破及宮內(nèi)感染，也可導(dǎo)致新生兒發(fā)生肺炎、腦膜炎、敗血癥等。2018年孕前和孕期保健指南中提到對(duì)高危因素的孕婦妊娠35～37周進(jìn)行GBS篩查。

本指導(dǎo)原則所述GBS核酸檢測試劑指基于分子生物學(xué)相關(guān)方法的核酸檢測技術(shù)，以GBS核酸序列為檢測靶標(biāo)，對(duì)來自人體樣本（如孕婦陰道拭子、直腸拭子、陰道和直腸聯(lián)合拭子）或經(jīng)增菌培養(yǎng)后人體樣本中的GBS進(jìn)行體外定性檢測的試劑。結(jié)合臨床表現(xiàn)和其他實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，用于GBS感染實(shí)驗(yàn)室診斷及臨床應(yīng)用。

本指導(dǎo)原則適用于基于實(shí)時(shí)熒光PCR（Real-time polymerase chain reaction）檢測方法的GBS核酸檢測試劑。對(duì)于其他方法，可能部分要求不完全適用或本文所述內(nèi)容不夠全面，申請(qǐng)人可以根據(jù)產(chǎn)品特性對(duì)適用部分進(jìn)行評(píng)價(jià)或補(bǔ)充其他的評(píng)價(jià)資料進(jìn)行相應(yīng)性能的驗(yàn)證，但需闡述不適用的理由，并說明替代方法的科學(xué)合理性。

二、注冊(cè)申報(bào)資料要求

（一）綜述資料

綜述資料主要包括產(chǎn)品預(yù)期用途、產(chǎn)品描述、有關(guān)生物安全性的說明、研究結(jié)果的總結(jié)評(píng)價(jià)以及同類產(chǎn)品上市情況介紹等內(nèi)容。其中同類產(chǎn)品上市情況介紹部分應(yīng)著重從方法學(xué)、不同臨床型別檢出能力、樣本類型、樣本采集與制備方式等方面寫明擬申報(bào)產(chǎn)品與目前市場上已獲批準(zhǔn)的同類產(chǎn)品之間的主要區(qū)別。

（二）主要原材料的研究資料

    提供主要原材料如引物、探針、酶、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、內(nèi)對(duì)照（內(nèi)標(biāo)）以及企業(yè)參考品等的選擇與來源、制備過程、質(zhì)量分析和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)等的研究資料。詳細(xì)說明基因位點(diǎn)選擇的依據(jù)，并提供能夠覆蓋臨床型別的證據(jù)。若主要原材料為企業(yè)自己生產(chǎn)，其生產(chǎn)工藝必須相對(duì)穩(wěn)定，并提供其詳細(xì)制備過程；如主要原材料購自其他供貨商，應(yīng)提供的資料包括：供貨商提供的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、出廠檢定報(bào)告或性能指標(biāo)證書，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗(yàn)資料。   

    申報(bào)試劑的質(zhì)控體系通過設(shè)置陽性、陰性、內(nèi)對(duì)照（內(nèi)標(biāo)）等各種對(duì)照來實(shí)現(xiàn)，需考慮對(duì)樣本核酸提取/純化、配液及加樣、試劑及儀器性能、擴(kuò)增反應(yīng)抑制物（管內(nèi)抑制）、交叉污染、靶核酸降解等因素可能造成的假陰性或假陽性結(jié)果的質(zhì)量控制。企業(yè)應(yīng)對(duì)各種對(duì)照的Ct值或相應(yīng)判斷數(shù)值做出明確的范圍要求。

1.內(nèi)對(duì)照（內(nèi)標(biāo)）

內(nèi)對(duì)照可對(duì)實(shí)驗(yàn)過程可能存在的擴(kuò)增反應(yīng)抑制物、儀器、試劑和操作等所導(dǎo)致的假陰性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制。申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)內(nèi)對(duì)照的引物、探針和模板濃度做精確的驗(yàn)證，既要保證內(nèi)標(biāo)熒光通道呈明顯的陽性曲線又要盡量降低對(duì)靶核酸序列檢測造成的抑制而導(dǎo)致假陰性。

2.陽性對(duì)照

陽性對(duì)照可對(duì)實(shí)驗(yàn)過程進(jìn)行質(zhì)控。陽性對(duì)照建議采用含有靶核酸序列的GBS菌株或者人工構(gòu)建的質(zhì)粒等，企業(yè)應(yīng)對(duì)陽性對(duì)照的Ct值做出明確的范圍要求。

3.陰性對(duì)照

陰性對(duì)照對(duì)可能存在的交叉污染產(chǎn)生的假陽性結(jié)果或擴(kuò)增反應(yīng)中背景值進(jìn)行質(zhì)量控制。陰性對(duì)照應(yīng)參與樣本處理和檢測的全過程。建議采用與實(shí)際檢測樣本具有相同或相似性狀的基質(zhì)溶液作為陰性對(duì)照，不推薦采用水作為陰性對(duì)照。

4.PCR組分的主要材料（包括脫氧三磷酸核苷、引物和探針、各種酶等主要原料）的選擇、制備、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)及實(shí)驗(yàn)研究資料，主要包括以下內(nèi)容：

4.1脫氧三磷酸核苷（dNTP）

核酸的組成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP，對(duì)純度、濃度、保存穩(wěn)定性等詳細(xì)驗(yàn)證資料。

4.2引物和探針：

應(yīng)詳述引物和探針的設(shè)計(jì)原則，提供引物、探針核酸序列、模板核酸序列及兩者的對(duì)應(yīng)情況。建議設(shè)計(jì)兩套或多套引物、探針以供篩選，針對(duì)所有預(yù)期適用型別進(jìn)行檢出能力和特異性（如交叉反應(yīng)）的評(píng)價(jià)，選擇最佳組合，并提交篩選的研究數(shù)據(jù)。

如為外購，引物和探針應(yīng)提供合成機(jī)構(gòu)出具的質(zhì)檢證明，如純度（應(yīng)達(dá)到電泳級(jí)或HPLC級(jí)）、序列準(zhǔn)確性等，申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)引物和探針核酸序列準(zhǔn)確性、純度、濃度、探針標(biāo)記的熒光素或化學(xué)發(fā)光物等進(jìn)行核實(shí)，同時(shí)申請(qǐng)人應(yīng)進(jìn)行功能性驗(yàn)證，并提供相關(guān)資料。

4.3 PCR反應(yīng)所需酶

DNA聚合酶，應(yīng)具有DNA聚合酶活性，無核酸內(nèi)切酶活性，具熱穩(wěn)定性，如：94℃保溫1小時(shí)后仍保持50%活性；尿嘧啶糖基化酶（UNG），具有尿嘧啶糖基化活性，無核酸外切酶及核酸內(nèi)切酶活性，應(yīng)對(duì)酶活性有合理驗(yàn)證；應(yīng)提供有關(guān)保存穩(wěn)定性、活性及功能性實(shí)驗(yàn)等驗(yàn)證資料。

5.企業(yè)參考品

申請(qǐng)人應(yīng)提供企業(yè)參考品的詳細(xì)制備過程，包括組成、來源、菌株特性（如名稱、型別、靶核酸的拷貝數(shù)/細(xì)菌濃度等）信息。企業(yè)參考品的項(xiàng)目應(yīng)包括：陰性參考品、陽性參考品、最低檢測限參考品、精密度參考品等。陽性參考品、最低檢出限參考品應(yīng)能覆蓋臨床常見型別，至少包括Ia、Ib、III、V等。陽性參考品、最低檢測限參考品、精密度參考品等建議采用滅活的菌株。陰性參考品應(yīng)至少包含分析性能研究資料中交叉反應(yīng)必須驗(yàn)證的微生物。

（三）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料

1.介紹產(chǎn)品主要生產(chǎn)工藝，可以圖表方式表示，并說明主要生產(chǎn)工藝的確定依據(jù)。

2.反應(yīng)原理介紹。

    3.詳述樣本采集、樣本處理方式的選擇（如對(duì)樣本采集拭子和保存液的驗(yàn)證，樣本類型為增菌后的人體樣本，需驗(yàn)證配套的增菌培養(yǎng)基），提供相關(guān)的研究資料。

4.核酸提取/純化方法確定的研究資料。

5.確定最佳PCR反應(yīng)體系的研究資料，包括酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度、樣本量及反應(yīng)體積等以及PCR各階段溫度、時(shí)間及循環(huán)數(shù)的研究資料。

    6.不同適用機(jī)型的反應(yīng)條件的對(duì)比分析，如果有差異應(yīng)分別詳述。  

（四）分析性能研究資料

申請(qǐng)人應(yīng)提交生產(chǎn)者在產(chǎn)品研制或成品驗(yàn)證階段對(duì)試劑盒進(jìn)行的所有性能驗(yàn)證的研究資料，對(duì)于每項(xiàng)分析性能的評(píng)價(jià)都應(yīng)包括具體研究目的、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、研究方法、可接受標(biāo)準(zhǔn)、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)方法等詳細(xì)資料。有關(guān)分析性能驗(yàn)證的背景信息也應(yīng)在申報(bào)資料中有所體現(xiàn)，包括實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)（實(shí)驗(yàn)室）、適用儀器、試劑規(guī)格、批號(hào)、臨床樣本來源等。分析性能評(píng)價(jià)的實(shí)驗(yàn)方法可以參考相關(guān)的美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)批準(zhǔn)指南（CLSI-EP）文件或國內(nèi)有關(guān)體外診斷產(chǎn)品性能評(píng)估的指導(dǎo)原則進(jìn)行，建議著重對(duì)以下分析性能進(jìn)行研究。

1.GBS DNA提取

細(xì)菌DNA提取主要有以下目的：富集目的基因濃度、保證目的基因序列的完整性、增加PCR模板溶液均一性、去除PCR抑制物，是決定PCR成敗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，無論申報(bào)產(chǎn)品是否含有DNA分離/純化的組分，企業(yè)都應(yīng)對(duì)核酸提取的環(huán)節(jié)做詳細(xì)的驗(yàn)證。臨床標(biāo)本中可能含有各式各樣的PCR抑制物，因此，對(duì)于DNA提取試劑的選擇，除最大量分離出目的DNA外，還應(yīng)有純化步驟，盡可能去除PCR抑制物。目前常見的DNA分離純化方法和改良方法各有優(yōu)勢和不足，申請(qǐng)人應(yīng)結(jié)合申報(bào)產(chǎn)品的特性，合理選擇DNA分離/純化試劑，并提供詳細(xì)的驗(yàn)證資料。

2.最低檢出限

2.1最低檢測限的確定

建議使用GBS菌株的梯度稀釋液來確定最低檢測限。每個(gè)梯度進(jìn)行不少于20次的重復(fù)檢測，將具有95%陽性檢出率的最低菌株濃度作為最低檢測限。應(yīng)明確每份菌株的來源、濃度、制備方法等信息。

2.2最低檢測限的驗(yàn)證

建議使用最低檢測限水平的菌株濃度，對(duì)不同來源的GBS菌株或真實(shí)臨床樣本進(jìn)行至少20次的重復(fù)驗(yàn)證，陽性檢出率不低于95%。注冊(cè)申請(qǐng)人應(yīng)能夠提供用于最低檢測限驗(yàn)證的各個(gè)菌株或臨床樣本的來源、制備方法及濃度等信息。最低檢測限建議采用菌落形成單位（CFU）和靶核酸的拷貝數(shù)兩種方法分別進(jìn)行研究。

最低檢測限的確定和驗(yàn)證需要覆蓋臨床常見型別，至少包括Ia、Ib、III、V等。

3.反應(yīng)性（包容性）

建議使用具有時(shí)間和區(qū)域特征性的不同來源的臨床樣本進(jìn)行驗(yàn)證，至少包括GBS臨床常見型別，如Ia、Ib、III、V等。建議在略高于最低檢測限濃度進(jìn)行研究，并提供樣本的來源、濃度、菌株型別的確認(rèn)方法等信息。

4.精密度

注冊(cè)申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)精密度指標(biāo)，如標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)等評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求。精密度研究需要覆蓋臨床常見臨床型別，至少包括Ia、Ib、III、V等。精密度評(píng)價(jià)試驗(yàn)應(yīng)包含核酸分離/純化步驟。針對(duì)本類產(chǎn)品的精密度評(píng)價(jià)主要包括以下要求。

4.1對(duì)可能影響檢測精密度的主要變量進(jìn)行驗(yàn)證，除檢測試劑（包括核酸分離/純化組分）本身的影響外，還應(yīng)對(duì)分析儀、操作者、地點(diǎn)、檢測輪次等要素進(jìn)行相關(guān)的驗(yàn)證。

4.2設(shè)定合理的精密度評(píng)價(jià)周期，例如：為期至少20天的檢測，具體方案可參考EP文件進(jìn)行。從而對(duì)批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間以及不同操作者之間的精密度進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

4.3用于精密度評(píng)價(jià)的菌株或臨床樣本均應(yīng)至少包含3個(gè)水平：陰性樣品、臨界陽性樣品、（中或強(qiáng)）陽性樣品，并根據(jù)產(chǎn)品特性設(shè)定適當(dāng)?shù)木芏纫?，臨床樣本精密度評(píng)價(jià)中的每一次檢測均應(yīng)從核酸提取開始。

4.3.1陰性樣本：待測物濃度低于最低檢測限或?yàn)榱銤舛?，陰性檢出率為100%（n≥20）；

4.3.2臨界陽性樣本：待測物濃度略高于試劑盒的最低檢測限，陽性檢出率為100%（n≥20）；

4.3.3中/強(qiáng)陽性樣本：待測物濃度呈中度到強(qiáng)陽性，陽性檢出率為100%且CV≤5%（n≥20）。

5.特異性

5.1交叉反應(yīng)

5.1.1用于GBS檢測試劑交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病原體種類主要考慮以下幾方面：近緣菌、易引起相同或相似的臨床癥狀微生物、感染部位的定植菌等（推薦種類見表1）。

5.1.2建議在病毒和細(xì)菌感染的醫(yī)學(xué)相關(guān)水平進(jìn)行交叉反應(yīng)的驗(yàn)證。通常，細(xì)菌感染的水平為10⁶ CFU/mL或更高，病毒為10⁵ PFU/mL或更高。

5.1.3申請(qǐng)人應(yīng)提供所有用于交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病毒和細(xì)菌的來源、種屬/型別和濃度確認(rèn)等試驗(yàn)資料。有關(guān)交叉反應(yīng)驗(yàn)證的信息應(yīng)以列表的方式在產(chǎn)品說明書的【產(chǎn)品性能指標(biāo)】項(xiàng)中有所體現(xiàn)。

表1  用于交叉反應(yīng)研究的微生物（推薦）

（其中標(biāo)記*的項(xiàng)目為選擇性驗(yàn)證）

5.2干擾物質(zhì)

    建議注冊(cè)申請(qǐng)人根據(jù)所采集的樣本類型，針對(duì)可能存在的干擾情況進(jìn)行驗(yàn)證。建議在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度（“最差條件”）進(jìn)行評(píng)價(jià)，并在GBS臨界陽性水平進(jìn)行檢測。潛在干擾物質(zhì)的選取應(yīng)至少包括：血紅蛋白、白細(xì)胞、宮頸粘液、女性衛(wèi)生用品、陰道用抗真菌藥物等。

6.提供企業(yè)參考品驗(yàn)證資料：根據(jù)主要原材料研究資料中的企業(yè)參考品設(shè)置情況，采用三批產(chǎn)品對(duì)企業(yè)參考品進(jìn)行檢驗(yàn)并提供詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（如適用）。

7.其他需注意問題

對(duì)于適用多個(gè)機(jī)型的產(chǎn)品，應(yīng)提供如產(chǎn)品說明書【適用儀器】項(xiàng)中所列的所有型號(hào)儀器的性能評(píng)估資料。如適用于不同樣本類型，應(yīng)針對(duì)不同樣本類型分別驗(yàn)證。

（五）陽性判斷值研究資料

陽性判斷值確定資料主要指對(duì)申報(bào)產(chǎn)品核酸檢測的Ct值，即結(jié)果判斷的臨界值進(jìn)行確認(rèn)的資料。陽性判斷值研究資料樣本來源應(yīng)考慮不同年齡、地域等因素，盡可能考慮樣本來源的多樣性、代表性。如存在判定值灰區(qū)，應(yīng)提供灰區(qū)的確認(rèn)資料。建議申請(qǐng)人采用受試者工作特征（ROC）曲線的方式確定申報(bào)試劑用于結(jié)果判斷的臨界值。有關(guān)ROC曲線分析的細(xì)節(jié)，請(qǐng)參考國內(nèi)外相關(guān)的文件。如采用其他方法對(duì)陽性判斷值進(jìn)行確認(rèn)研究，應(yīng)說明其合理性。提供內(nèi)標(biāo)值的確定方法和研究資料。閾值設(shè)置應(yīng)科學(xué)合理。

另外，考慮建立陽性判斷值時(shí)使用的臨床樣本對(duì)于目標(biāo)人群的代表性，建議通過臨床評(píng)價(jià)進(jìn)一步驗(yàn)證和確認(rèn)陽性判斷值的準(zhǔn)確性。

（六）穩(wěn)定性研究資料

穩(wěn)定性研究資料主要涉及兩部分內(nèi)容，申報(bào)試劑的穩(wěn)定性和適用樣本的穩(wěn)定性研究。前者主要包括實(shí)時(shí)穩(wěn)定性（有效期）、運(yùn)輸穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性及凍融次數(shù)限制等研究，申請(qǐng)人可根據(jù)實(shí)際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括研究方法的確定依據(jù)、具體的實(shí)施方案、詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。對(duì)于實(shí)時(shí)穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批樣品在實(shí)際儲(chǔ)存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

應(yīng)對(duì)樣本穩(wěn)定性進(jìn)行研究，主要包括室溫保存、冷藏和冷凍條件下的有效期驗(yàn)證，可以在合理的溫度范圍內(nèi)選擇溫度點(diǎn)（溫度范圍），每間隔一定的時(shí)間段即對(duì)儲(chǔ)存樣本進(jìn)行分析驗(yàn)證，從而確認(rèn)不同類型樣本的穩(wěn)定性。適于冷凍保存的樣本還應(yīng)對(duì)凍融次數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

試劑穩(wěn)定性和樣本穩(wěn)定性兩部分內(nèi)容的研究結(jié)果均應(yīng)在說明書【儲(chǔ)存條件及有效期】和【樣本要求】兩項(xiàng)中進(jìn)行詳細(xì)說明。

（七）臨床評(píng)價(jià)資料

臨床試驗(yàn)的開展、方案的制定以及報(bào)告的撰寫等均應(yīng)符合相關(guān)法規(guī)及《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》（原國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第16號(hào)）的要求，如相關(guān)法規(guī)、文件有更新，臨床試驗(yàn)應(yīng)符合更新后的要求。

1.臨床試驗(yàn)方法

該產(chǎn)品可選擇境內(nèi)已批準(zhǔn)上市的同類產(chǎn)品作為對(duì)比試劑或選擇病原體增菌培養(yǎng)鑒定作為臨床參考標(biāo)準(zhǔn)，采用試驗(yàn)用體外診斷試劑（以下稱考核試劑）與之進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)研究，評(píng)價(jià)考核試劑的臨床性能。對(duì)比試劑的選擇應(yīng)從預(yù)期用途、樣本要求、檢測性能等方面，確認(rèn)其與考核試劑具有較好的可比性。

若選擇境內(nèi)已上市產(chǎn)品作為對(duì)比試劑，除與同類產(chǎn)品的對(duì)比試驗(yàn)之外，應(yīng)再選擇一定量的樣本與病原體增菌培養(yǎng)鑒定比對(duì)評(píng)價(jià)考核試劑的臨床靈敏度和特異性。

2.受試者選擇和樣本例數(shù)

2.1受試者選擇：臨床試驗(yàn)受試者應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品聲稱的適用人群進(jìn)行選擇，受試人群應(yīng)能夠代表目標(biāo)人群的特征，包括各種可能的干擾樣本、交叉反應(yīng)樣本（其它病原體陽性）等。

2.2樣本例數(shù)

臨床試驗(yàn)樣本量應(yīng)滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，可采用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行估算，同時(shí)應(yīng)滿足法規(guī)最低樣本量的要求。根據(jù)相應(yīng)臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)，本臨床試驗(yàn)可依據(jù)考核試劑相對(duì)于對(duì)比試劑的陰、陽性符合率或相對(duì)于臨床參考標(biāo)準(zhǔn)的靈敏度和特異度分別估算最低陰、陽性樣本例數(shù)。

以已上市同類產(chǎn)品作為對(duì)比試劑的比較研究中，臨床樣本量的估算建議采用公式（1）計(jì)算，陰陽性符合率的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)（P₀）建議不低于95%。當(dāng)評(píng)價(jià)指標(biāo)P接近100%時(shí)，該樣本量估算方法可能不適用，應(yīng)考慮選擇更加適宜的方法進(jìn)行樣本量估算和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，如精確概率法等。

………（1）

公式中，n為樣本量；Z_1-α、Z_1-β為顯著性水平和把握度的標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布的分?jǐn)?shù)位，P₀為評(píng)價(jià)指標(biāo)的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)，P_T為考核試劑評(píng)價(jià)指標(biāo)預(yù)期值。

以病原體增菌培養(yǎng)鑒定作為對(duì)比方法，臨床陽性樣本量的估算建議采用公式（1）計(jì)算，臨床靈敏度可接受標(biāo)準(zhǔn)（P₀）建議不低于90%。陰性樣本量的估算可不采用目標(biāo)值法，建議根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)獲得的特異度的預(yù)期值P采用公式（2）計(jì)算，Δ的取值建議不大于0.03，P和Δ的取值應(yīng)有充分依據(jù)，當(dāng)預(yù)期值P更高時(shí)應(yīng)考慮更優(yōu)的精度。

……………………（2）

公式中n為樣本量，Z_1-α/2為置信度標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布的分位數(shù)，P為評(píng)價(jià)指標(biāo)預(yù)期值，Δ為P的允許誤差大小。

對(duì)于選擇境內(nèi)已上市產(chǎn)品作為對(duì)比試劑，除同類產(chǎn)品比對(duì)試驗(yàn)之外，應(yīng)再選擇一定量的樣本與病原體增菌培養(yǎng)鑒定比對(duì)評(píng)價(jià)考核試劑的臨床靈敏度和特異性，該部分試驗(yàn)陰、陽性樣本量的估計(jì)建議采用公式（2）進(jìn)行估算，其中Δ的常用取值為0.05，當(dāng)預(yù)期值更高時(shí)應(yīng)考慮更優(yōu)的精度。

臨床試驗(yàn)總體樣本量確定時(shí)應(yīng)在上述陰、陽性樣本最低樣本量估算的基礎(chǔ)上，同時(shí)考慮其他可能造成受試者脫落的情況以及可能需要納入的干擾樣本、交叉反應(yīng)樣本等情況適當(dāng)增加入組樣本量。

此類產(chǎn)品的檢測樣本類型一般為直腸拭子、陰道拭子或直腸/陰道混合拭子，如果樣本類型同時(shí)包括直腸拭子和陰道拭子，鑒于同一病例其陰道和直腸感染狀態(tài)可能存在差異，因此對(duì)于這兩種拭子應(yīng)分別和對(duì)比試劑或臨床參考標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)進(jìn)行驗(yàn)證，不同拭子樣本量均應(yīng)分別滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，不宜使用同源比對(duì)的方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。

3.臨床研究單位的選擇

應(yīng)選擇不少于3家（含3家）已備案的臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)，按照相關(guān)法規(guī)、指導(dǎo)原則的要求開展臨床試驗(yàn)。臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的選擇應(yīng)充分考慮擬申報(bào)產(chǎn)品的特點(diǎn)和預(yù)期用途，綜合流行病學(xué)背景，鑒于不同地區(qū)及醫(yī)療機(jī)構(gòu)中GBS血清型的差異，建議選擇不同地區(qū)的臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)開展臨床試驗(yàn)，使臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)和受試者的選擇具有一定的地域代表性。且臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)應(yīng)具有分子生物學(xué)方法和微生物培養(yǎng)檢測的優(yōu)勢，實(shí)驗(yàn)操作人員應(yīng)有足夠的時(shí)間熟悉檢測系統(tǒng)的各環(huán)節(jié)，熟悉臨床試驗(yàn)方案。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)選擇合適的統(tǒng)計(jì)方法對(duì)臨床試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)于考核試劑與對(duì)比試劑/參考方法的一致性評(píng)價(jià)，常選擇交叉四格表形式總結(jié)兩種試劑的檢測結(jié)果，評(píng)價(jià)指標(biāo)一般包括臨床靈敏度、臨床特異度、陽性符合率、陰性符合率，kappa值等，對(duì)于不一致樣本，應(yīng)進(jìn)行可能的原因分析，如臨床試驗(yàn)方案規(guī)定采用其他方法進(jìn)行確認(rèn)，則確認(rèn)結(jié)果不應(yīng)納入統(tǒng)計(jì)分析。

5.倫理學(xué)要求

臨床試驗(yàn)必須符合赫爾辛基宣言的倫理學(xué)準(zhǔn)則。研究者應(yīng)考慮臨床試驗(yàn)用樣本的獲得和試驗(yàn)結(jié)果對(duì)受試者的風(fēng)險(xiǎn)，提請(qǐng)倫理委員會(huì)審查，并獲得倫理委員會(huì)的同意。注冊(cè)申報(bào)時(shí)應(yīng)提交倫理委員會(huì)的審查意見。

6.臨床試驗(yàn)方案

臨床試驗(yàn)實(shí)施前，研究人員應(yīng)從流行病學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)等多方面考慮，設(shè)計(jì)科學(xué)合理的臨床試驗(yàn)方案。各臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)應(yīng)執(zhí)行統(tǒng)一的臨床試驗(yàn)方案，且保證在整個(gè)臨床試驗(yàn)過程中遵循預(yù)定的方案實(shí)施，不可隨意改動(dòng)。整個(gè)試驗(yàn)過程應(yīng)在臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)并由本實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)人員操作完成，申報(bào)單位的技術(shù)人員除進(jìn)行必要的技術(shù)指導(dǎo)外，不得隨意干涉實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，尤其是數(shù)據(jù)收集過程。

試驗(yàn)方案中應(yīng)確定嚴(yán)格的病例納入/排除標(biāo)準(zhǔn)，任何已經(jīng)入選的病例再被排除出臨床試驗(yàn)都應(yīng)記錄在案并明確說明原因。在試驗(yàn)操作過程中和判定試驗(yàn)結(jié)果時(shí)應(yīng)采用盲法以保證試驗(yàn)結(jié)果的客觀性。

7.質(zhì)量控制

臨床試驗(yàn)開始前，建議進(jìn)行臨床試驗(yàn)的預(yù)試驗(yàn)，以熟悉并掌握相關(guān)試驗(yàn)方法的操作、儀器、技術(shù)性能等，最大限度控制試驗(yàn)誤差。整個(gè)試驗(yàn)過程都應(yīng)處于有效的質(zhì)量控制下，最大限度保證試驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及精密度。

8.臨床試驗(yàn)報(bào)告撰寫

臨床試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)該對(duì)試驗(yàn)的整體設(shè)計(jì)及各個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)給予清晰、完整的闡述，應(yīng)該對(duì)整個(gè)臨床試驗(yàn)實(shí)施過程、結(jié)果分析、結(jié)論等進(jìn)行條理分明的描述，并應(yīng)包括必要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)分析方法，最后得出臨床試驗(yàn)結(jié)論。臨床試驗(yàn)報(bào)告的撰寫參考《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》的相關(guān)要求。

（八）產(chǎn)品技術(shù)要求

申請(qǐng)人應(yīng)當(dāng)在原材料質(zhì)量和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的前提下，根據(jù)申請(qǐng)人產(chǎn)品研制、前期評(píng)價(jià)等結(jié)果，依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)文獻(xiàn)，按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導(dǎo)原則》（原國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第9號(hào)）的有關(guān)要求，編寫產(chǎn)品技術(shù)要求。產(chǎn)品技術(shù)要求還應(yīng)當(dāng)以附錄形式明確主要原材料、生產(chǎn)工藝及半成品要求。

如申報(bào)試劑已有適用的國家標(biāo)準(zhǔn)品、參考品發(fā)布，則申請(qǐng)人應(yīng)在產(chǎn)品技術(shù)要求中提出檢驗(yàn)要求。

（九）注冊(cè)檢驗(yàn)

根據(jù)《體外診斷試劑注冊(cè)管理辦法》要求，首次申請(qǐng)注冊(cè)的第三類產(chǎn)品應(yīng)在具有相應(yīng)醫(yī)療器械檢驗(yàn)資質(zhì)和承檢范圍的醫(yī)療器械檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)進(jìn)行連續(xù)三個(gè)生產(chǎn)批次樣品的注冊(cè)檢測。如申報(bào)試劑有適用的國家參考品，應(yīng)采用國家參考品進(jìn)行注冊(cè)檢驗(yàn)，并符合國家參考品的相關(guān)要求。

（十）產(chǎn)品說明書

說明書承載了產(chǎn)品預(yù)期用途、樣本采集及處理、檢驗(yàn)方法、檢驗(yàn)結(jié)果解釋以及注意事項(xiàng)等重要信息，是指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室工作人員正確操作、臨床醫(yī)生針對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果給出合理醫(yī)學(xué)解釋的重要依據(jù)。產(chǎn)品說明書的格式應(yīng)符合《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》（原國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第17號(hào)）的要求，進(jìn)口體外診斷試劑的中文說明書除格式要求外，其內(nèi)容應(yīng)盡量保持與原文說明書的一致性，翻譯力求準(zhǔn)確且符合中文表達(dá)習(xí)慣。產(chǎn)品說明書中相關(guān)技術(shù)內(nèi)容均應(yīng)與申請(qǐng)人提交的注冊(cè)申報(bào)資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致，如某些內(nèi)容引用自參考文獻(xiàn)，則應(yīng)以規(guī)范格式對(duì)此內(nèi)容進(jìn)行標(biāo)注，并單獨(dú)列明文獻(xiàn)的相關(guān)信息。

下面對(duì)B群鏈球菌核酸檢測試劑說明書的重點(diǎn)內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)說明。

1.【預(yù)期用途】

應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：

1.1試劑盒用于對(duì)來自人體樣本（如孕婦陰道拭子、直腸拭子、陰道和直腸聯(lián)合拭子）或經(jīng)增菌培養(yǎng)后人體樣本中的GBS進(jìn)行體外定性檢測。適用樣本類型應(yīng)依據(jù)申報(bào)產(chǎn)品的分析性能評(píng)估和臨床研究情況進(jìn)行確認(rèn)。

1.2目標(biāo)物的特征：簡要描述病原體生物學(xué)特征及致病性，感染后臨床表現(xiàn)，相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室診斷方法等。

1.3目標(biāo)人群：例如妊娠35～37周高危因素的孕婦（如合并糖尿病、前次妊娠出生的新生兒有B群鏈球菌感染等），有胎膜早破、先兆早產(chǎn)等臨床癥狀醫(yī)生認(rèn)為有必要進(jìn)行GBS檢測的其他孕周數(shù)孕婦等，不建議使用該試劑盒對(duì)無癥狀的孕早、中期孕婦進(jìn)行篩查。

1.4產(chǎn)品功能：結(jié)合目標(biāo)人群的臨床表現(xiàn)和其他診斷指標(biāo)，可用于B群鏈球菌感染的輔助診斷。

2.【檢驗(yàn)原理】

2.1描述試劑盒檢測能夠覆蓋的目標(biāo)基因序列特征，引物及探針的設(shè)計(jì)，反應(yīng)體系（管）組合形式，內(nèi)對(duì)照（內(nèi)標(biāo)）和陰陽質(zhì)控品的設(shè)置及熒光信號(hào)標(biāo)記等。

2.2描述核酸提取純化的方法、原理等。

2.3描述試劑盒的技術(shù)原理，可結(jié)合圖示進(jìn)行說明。如反應(yīng)體系中添加了相關(guān)的防止擴(kuò)增產(chǎn)物污染組分（如尿嘧啶糖基化酶），也應(yīng)介紹其作用機(jī)理。

3.【主要組成成分】

3.1詳細(xì)說明試劑盒內(nèi)各組分的名稱、數(shù)量、成分、濃度等信息，如含有生物源性物質(zhì)，應(yīng)說明其生物學(xué)來源、活性及其他特性。說明不同批號(hào)試劑盒中各組分是否可以互換。

3.2如果試劑盒中不包含用于核酸分離/純化的試劑組分，應(yīng)在此明確經(jīng)驗(yàn)證后推薦配合使用的核酸分離/純化試劑盒的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱、備案號(hào)以及配合使用的儀器等信息。

3.3試劑盒中不包含但對(duì)該項(xiàng)檢測必需的組分，應(yīng)列出相關(guān)試劑的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱以及備案憑證號(hào)或注冊(cè)證號(hào)（如有）等信息。

4.【儲(chǔ)存條件及有效期】

說明試劑盒的效期穩(wěn)定性、開封穩(wěn)定性、復(fù)溶穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性、凍融次數(shù)要求等，應(yīng)標(biāo)明具體的儲(chǔ)存條件及效期。

5.【適用儀器】

注明所有適用的儀器型號(hào)，并提供與儀器有關(guān)的重要信息以指導(dǎo)用戶操作。

6.【樣本要求】

6.1樣本收集要求：結(jié)合臨床公認(rèn)推薦的采樣要求。建議注明配套驗(yàn)證的拭子種類或生產(chǎn)廠家。

6.2樣本處理、運(yùn)送及保存：如果使用增菌培養(yǎng)后的人體樣本建議注明配套使用的增菌培養(yǎng)基。核酸提取前的預(yù)處理、保存條件及時(shí)間、運(yùn)輸條件等。冷藏/冷凍樣本檢測前是否須恢復(fù)室溫，凍融次數(shù)限制等。

7.【檢驗(yàn)方法】

詳細(xì)說明操作的各個(gè)步驟，例如：

7.1試劑準(zhǔn)備及配制方法、注意事項(xiàng)。

7.2詳細(xì)描述待測樣本、質(zhì)控品的核酸提取/純化方法，包括條件、步驟及注意事項(xiàng)。

7.3擴(kuò)增反應(yīng)前準(zhǔn)備：加樣體積、順序等。

7.4 PCR各階段的溫度、時(shí)間設(shè)置、循環(huán)設(shè)置及注意事項(xiàng)。

7.5儀器設(shè)置：特殊參數(shù)、結(jié)合探針的熒光素標(biāo)記情況設(shè)置目標(biāo)基因及內(nèi)標(biāo)的熒光通道。

7.6基線、循環(huán)閾值（Ct值）的選擇方法。

7.7質(zhì)量控制方法：試劑盒內(nèi)陰/陽性質(zhì)控品、內(nèi)對(duì)照（內(nèi)標(biāo)）的Ct值范圍要求。

8.【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

結(jié)合陽性對(duì)照、陰性對(duì)照、內(nèi)對(duì)照（內(nèi)標(biāo)）以及目標(biāo)基因的檢測結(jié)果，以列表形式詳細(xì)描述所有可能出現(xiàn)的結(jié)果組合及相應(yīng)的解釋，可用Ct值表示。如存在灰區(qū)，應(yīng)同時(shí)說明對(duì)灰區(qū)結(jié)果的處理方式，包括在何種情況下需要進(jìn)行重復(fù)檢測，重復(fù)檢測的方法，對(duì)樣本可能采取的優(yōu)化條件（如采集要求或采集方法）等。如適用，也可結(jié)合擴(kuò)增結(jié)果的S形曲線對(duì)灰區(qū)結(jié)果進(jìn)行判定。

9.【檢驗(yàn)方法局限性】

9.1本試劑盒的檢測結(jié)果應(yīng)結(jié)合患者的癥狀/體征、病史、其他實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果等情況進(jìn)行綜合分析以及解釋，不得作為患者臨床診治或管理的唯一依據(jù)。

9.2導(dǎo)致假陰性/假陽性結(jié)果的可能性分析：

9.2.1不合理的樣本采集、處理、運(yùn)輸及保存條件，樣本中目標(biāo)物濃度過低；

9.2.2 B群鏈球菌核酸目標(biāo)基因序列的變異或其他原因?qū)е碌男蛄懈淖儯?/span>

9.2.3同一患者不同時(shí)間、不同部位或者多次采集樣本會(huì)降低假陰性結(jié)果的可能性；

9.2.4未經(jīng)驗(yàn)證的其他干擾，如內(nèi)源性或外源引入樣本的物質(zhì)；

9.2.5樣本間的交叉污染；

9.2.6未經(jīng)驗(yàn)證的其他交叉反應(yīng)物質(zhì)。

10.【產(chǎn)品性能指標(biāo)】詳述以下性能指標(biāo)：

10.1最低檢出限：說明試劑的最低檢出濃度，簡單介紹最低檢出限的確定及驗(yàn)證方法。

10.2企業(yè)陽性/陰性參考品符合率：簡單介紹陽性/陰性參考品組成、來源以及濃度等信息。

10.3精密度：說明不同類型樣本的重復(fù)性和再現(xiàn)性評(píng)價(jià)結(jié)果。

10.4分析特異性：包括交叉反應(yīng)和干擾物質(zhì)

10.4.1可能產(chǎn)生交叉反應(yīng)的其他病原體的驗(yàn)證情況，建議以列表的方式描述病原體名稱、型別、濃度等信息；

10.4.2樣本中常見干擾物質(zhì)對(duì)檢測結(jié)果的影響，應(yīng)注明可接受的最高限值。

10.5臨床試驗(yàn)：簡要介紹試驗(yàn)方法、受試者及樣本、試驗(yàn)結(jié)果和結(jié)論等。

11.【注意事項(xiàng)】應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：

11.1有關(guān)人源組分（如有）的警告，如：試劑盒內(nèi)質(zhì)控品或其他可能含有人源物質(zhì)的組分，雖已通過乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、人類免疫缺陷病毒抗體（抗-HIV1/2）、丙型肝炎抗體（抗-HCV）等項(xiàng)目的檢測為陰性，但截至目前，沒有任何一項(xiàng)檢測可以確保絕對(duì)安全，故仍應(yīng)將這些組分作為潛在傳染源對(duì)待。

11.2臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格按照《臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范》配備設(shè)備及操作人員，應(yīng)嚴(yán)格按照說明書要求進(jìn)行操作。

三、參考文獻(xiàn)

1.《體外診斷試劑注冊(cè)管理辦法》（原國家食品藥品監(jiān)督管理總局令第5號(hào)）.2014年7月

2.《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》，（原國家食品藥品監(jiān)督管理總局公告2014年第16號(hào)）.2014年9月

3.《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》，（原國家食品藥品監(jiān)督管理總局公告2014年第17號(hào)）.2014年9月

4.《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》（原國家食品藥品監(jiān)管總局公告2014年第44號(hào)）.2014年9月

5.中華醫(yī)學(xué)會(huì)婦產(chǎn)科學(xué)分會(huì)產(chǎn)科學(xué)組，孕前和孕期保健指南（2018），中華圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)雜志，2018年3月第21卷第3期：145-152.

四、起草單位

國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心